嘉靖四十一年（1562年），高拱升禮部左侍郎兼學士。次年改吏部左侍郎仍兼學士，掌詹事府事。他數次主或副主會試，所撰科舉示範文章頗見稱道。但一次在進題中「以字嫌忤上意」，幾乎有所行遣。徐階出面辯解，才使事懈。四十四年，景王在藩薨，裕王地位確立。高拱升禮部尚書，召入直廬，並以青詞見寵，得賜飛魚服。四十五年（1566）三月，由徐階薦舉，以禮部尚書兼文淵閣大學士。
高拱相貌瑰奇，為人豪爽有才略，又頗自許。甫入閣，即欲展抱負示才。當時世宗久居西苑，大臣率以召入直廬為榮，閣事有所不周。世宗因諭曰：「閣中政本可輪一人往」。
首輔徐階及「青詞宰相」袁煒以不能離開世宗須臾為由，不去閣中辦公。高拱對徐階說：「公元老，常直可矣。不才與李（春芳）、郭（樸）兩公願日輪一人，詣閣中習故事。」李春芳雖早入閣，但對徐階向來十分恭謹，「側行傴僂若屬吏」。郭璞與高拱同時新入閣，且都由徐階薦舉，似應對階更為謙卑。拱卻言直如此，徐階「拂然不樂」。高拱與郭璞又同為河南鄉曲，「兩人相與歡甚」，徐階知後也不悅，因此芥蒂漸結。未幾，吏科給事中胡應嘉奏劾高拱。先是高拱因年過半百膝下無子焦慮萬分，遂將家移至西華門附近，直廬時常偷偷回家與妻妾團圓。一次聽說世宗病情危急，高拱急忙把自己直廬內的書籍、器物等盡行取出。胡應嘉因此奏劾：「拱輔政初，即以直廬為隘，移家西安門外，夤夜潛歸」，「皇上違和，正臣子籲天請代之時，而拱乃為歸計，此何心也」。高拱大懼，幸世宗病篤，未加深責。但高拱以胡應嘉為徐階鄉人，其奏劾又是徐階擬旨報世宗的，故疑胡應嘉受徐階指使，增添了對徐階的不滿和怨恨。
四十五年（1566）十二月世宗死，徐階與自己的門生、剛充當裕王府講官的張居正密草遺詔，卻不與同列謀議。詔下，高拱、郭璞惘然若失。高拱以自己是新帝肺腑之臣，卻對遺詔渾然不知，因而與徐階構怨更深。穆宗即位後，徐階以碩德元老仍居首輔位，旋又引張居正入閣，高拱心不能平，在論登極、賞軍事、去留大臣是否請上裁決等問題上，數與徐階抗爭，矛盾日趨表面化。隆慶元年正月，胡應嘉謫外，言路認為出於高拱指，於是群起交章攻之。給事中歐陽一敬奏劾尤力，將高拱比作蔡京。高拱怒甚，請徐階擬旨責杖奏劾者，徐階不應。高拱被迫求退，穆宗不允。徐階屈於皇帝的意思，也擬旨慰留，但絕無譴責言官，高拱越發生氣，一次公開在閣中與徐階舌戰。高拱攻擊說：「公在先帝時導之為齋詞以求媚。宮車甫晏駕而一旦即扳之。今又結言路而逐其藩國腹心之臣，何也？」詰問之勢洶洶。徐階徐徐辯答曰：「夫言路口故多，我安能一一而結之，又安能使之攻公。且我能結之，公獨不能結之耶？」他又說，我並非是背叛先帝，以遺詔讓先帝自責是為先帝收人心……。至於齋詞一事，徐階坦認「因我罪」。但他反問高拱：「獨不記在禮部時，先帝以密札問我：『拱有疏，願得效力於齋事，可許否？』此札今尚在！」高拱頓時「頰赤語塞」，打了個敗仗。但高拱並不甘心，他以徐階子弟和家人在鄉里橫行不法事攻訐徐階，並授意門生齊康劾徐階。徐階疏辯乞休。當時徐階正因遺詔復起世宗時被謫諸官而受到部院大臣、科道言官的感恩擁戴，權勢灼熱，故言路交章請留徐階，還集體去徐階第敦勸視事，另外極論齊康、高拱罪狀，甚至群集闕下，吐唾辱罵齊康、高拱。三月之內論劾高拱的奏疏竟多達三十餘份，高拱不自安，連疏十二，稱病乞休。穆宗挽留不能，遂准以少傅兼太子太傅、尚書、大學士銜回鄉養疾，遣行人護送。齊康則坐黜外調，郭璞不久也乞歸回裡。