王朝更迭之際，散處在各地的宣教士，由於環境不同，對當時的政局變動各自作出了不同的反應。如意大利人艾儒略、陽瑪諾，在福建延平艱苦地著書、傳教；在南京的畢方濟則充當了明福王的使臣，前往澳門向葡萄牙人搬救兵，後畢方濟一直活躍在南明各政權當中；在成都的利思類、安文思，則當上了大西國皇帝張獻忠的「天學國師」。
當時湯若望和龍華民都留在北京宣武門的教堂內，本來清軍下令內城居民一律限三日搬出，以便讓八旗兵民居住。湯若望上奏清廷，請求准許留住城內。出乎意料的是奏折遞上去第二天就得到攝政王多爾袞的批復，准許他們安居天主堂，不許各旗兵弁滋擾。不久，湯若望被召入朝，多爾袞詢問重修曆法之事，任命他為欽天監監正。順治二年（1645）啟用新歷，頒行天下。因治歷有功，次年湯若望被加太常寺少卿銜，並獲賜宣武門內天主堂側空地一塊，由孝莊文皇太后率親王官紳出資，重建教堂。
順治親政後，與湯若望關係甚密，賜號「通玄教師」，為教堂書匾「通玄佳境」，並親撰《御制天主堂碑記》，褒獎湯若望治歷之功，讚揚其信仰。為了表示尊敬，順治帝稱湯若望為「瑪法」，是滿語中對長輩的尊稱。又准他每日隨意出入朝中，凡有啟奏，可以徑直進入內廷，不循常例。不過湯若望每次苦勸順治信教，都沒有結果。
順治年間（1644—1661）天主教在華宣教取得巨大果效，據1664年統計，當時耶穌會已在中國直隸（今河北）、山東、山西、陝西、河南、四川、湖廣（今湖南、湖北）、江西、福建、浙江、江南（今江蘇）11省傳教建堂，共有教徒114200人。
一、曆法之爭
1662年，順治去世，年僅8歲的玄燁即位，年號康熙。國家政務由索尼、遏必隆、蘇克薩哈、鰲拜4個輔政大臣掌管。其中鰲拜專權，扶植親信，打擊異己，飛揚跋扈，不可一世。早在順治末年，官生楊光先就曾上書，指責湯若望等造歷謬誤，未得理睬。現在他看準鰲拜被喜歡宣教士，再次發難，更加激烈地對湯若望等西方宣教士進行全面攻擊，指責《時憲歷》敢用「依西洋新法」五字，是暗竊正朔以尊西洋，「明示天下以大清奉西洋正朔」。另外，湯若望將大清歷書只編至二百年，意思是要大清王朝短命而亡。楊光先攻擊宣教士圖謀顛覆清朝，以修歷為名，陰行邪教，窺探朝廷機密，屯兵澳門，接渡海上往來。因此要求將湯若望等正法。這番蠱惑人心、聳人聽聞的煽動，果然引起了清廷的疑慮，社會上儒家、佛家等仇視天主教的也群起附和。於是，1664年輔政大臣下令逮捕湯若望，當時湯若望已73歲高齡，又患中風，四肢癱瘓，口齒不清，受審時只好由其助手南懷仁代為申辯。一時冤獄大興，南懷仁、利類思、安文思及各省宣教士紛紛被捕。當年秋、冬，吏部、禮部進行調查審訊，清廷也派人到廣東查核，並未查實。但結果仍是楊光先勝訴，將湯若望判處凌遲，其他人分別斬首流徒。恰逢北京發生強烈地震，京師人心恐慌，以為獄訟不公，天象示警。康熙帝的祖母孝莊文太皇太后出面干預，輔政大臣將湯若望案件奏請太皇太后定奪，太皇太后閱奏後大為不悅，將奏折扔在地上。斥責輔政大臣，下令釋放。宣教士們倖免於難，但新歷的5名中國官員（均為天主教徒）仍被處決，一些信教官員被革職。
惡意排斥西法的楊光先雖然取得了勝利，但他接任欽天監正，實在是用人不當，因為他的歷算知識甚為有限，監內工作一片混亂，屢次錯測節氣時日，錯報日月食的時間。所用《大統歷》、《回回歷》都是過時曆法，須作根本改訂。楊光先自知力難勝任，再三要求辭職，但未獲准許。
1668年，14歲的康熙帝與鰲拜的矛盾日益尖銳，在曆法這一敏感問題上首先表現出來。當時欽天監的錯誤已鬧得滿城風雨，而鰲拜仍極力回護。康熙召集楊光先、南懷仁一起討論天文曆法。命大學士和他們一起到觀象台，預推正午日影所止之處，經過3天實地測驗，南懷仁推測無誤，楊光先等都有誤差。康熙命南懷仁審查楊光先所訂歷書，結果錯誤百出。為了進一步驗證，康熙又安排了立春、雨水兩個節氣以及月亮、火星、木星運行的五項測驗，令大臣們共同觀察，結果南懷仁所言逐款皆符，而楊光先逐款不合。西洋曆法以實際測算的準確性取得勝利，楊光先被革職，他還喋喋不休地抗辯，被康熙斥罵了一頓，逐回原籍，中途病死。1669年康熙親政，為湯若望平反，親撰祭文並參加葬禮。
曆法之爭最後告終，南懷仁接任欽天監正，此後，許多宣教士在他的推薦下來到北京，在清廷供職。他們有的從事天文曆法，改造北京觀象台，製作天文儀器；有的出入宮廷，充當皇家教師，給康熙講授數學、天文、物理知識；有的從事音樂、繪畫、雕刻；有的在造辦處，指導工人製作自鳴鐘和其它機械；還有的協助清政府製作全國地圖，在各省實地測繪，準確地完成了著名的《皇輿全覽圖》。
隨著湯若望冤獄的興起，全國範圍內展開針對宣教士的大搜捕，信徒的宗教活動亦被禁止。湯若望被平反後，被捕的二十餘位宣教士仍被關押在廣東，各省仍禁止天主教活動。於是，在京神父們採取了一項大膽的行動，決意辭去歷官職務。康熙知道他們的用意，便派國舅佟國綱慰留，並且告訴他們姑且忍耐等待，因為朝中尚有許多反教的人，驟弛禁教令恐有不妥。神父們因而知道皇帝並無仇教之意，便達致諒解。
直到1670年，康熙才頒布開釋宣教士的上諭，一方面准許廣州25位教士各歸本堂，一方面不准添立教堂，也不准中國人入教。雖有諸多限制，但宣教工作終歸又可以合法展開。康熙帝對南懷仁十分信任、友好和尊敬，且對其他宣教士也十分友好和寬容，歷次南巡，所到之處，經常召見宣教士，詢問他們的生活與工作。1693年，康熙患瘧疾，太醫久治不愈，宣教士張誠送上南洋帶來的奎寧，一服而愈。為表謝意，康熙賜地建堂，名「救世主堂」，即今北堂前身。宣教工作在康熙朝前40年，取得較大進展。
二、禮儀之爭
正當在華宣教事業進展順利之時，教會內部卻因禮儀問題發生爭執，史稱「禮儀之爭」。
《新天主教百科全書》給「中國禮儀之爭」的定義有三方面的內容：一是士人祀孔；二是家人祭祖；三是中西文中間有關基督教上帝的語義和語源學的爭議，稱「譯名之爭」。「譯名之爭」最早發生在耶穌會士之間。簡單地說，就是在中文中如何正確地選用適當詞彙來翻譯神的名。是用「天」、「上帝」，還是用「天主」。在華的幾十個傳教士之間有不同的看法，展開了神學討論。時至17世紀30年代，「中國禮儀之爭」擴大到天主教內部。關鍵問題仍然是：按天主教教義來看，在中國士大夫和民間流行的「祭孔祀天」禮儀是否屬於異端？教會能否對已經皈依天主教，並參加教堂生活的中國教徒的祭祖習慣加以容忍？
這場爭論在中國和歐洲逐漸涉及不同態度的四方人員：1、為中國禮儀抗辯的耶穌會士，以及由他們帶領的中國信徒；2、強烈反對耶穌會的其他修會，包括多明我會、方濟各會、奧古斯丁會、巴黎外方傳教會；3、對在華各派傳教士的糾紛難下判斷，而又必須做出裁決的羅馬教廷；4、因外國教士和教皇干涉中國事務而終致惱怒的康熙皇帝。
這場爭論的後果是極不痛快的，爭論中任何一方都未在隨後發生的事件中獲得什麼。相反，各個修會都被中國皇帝逐出境外，羅馬教廷幾乎喪失了經歷150年艱辛開闢得來的中國教會。而所有對西方文明有興趣的中國人，從皇帝到士大夫及基督徒，也失去了接觸西方文明的機會。
「中國禮儀之爭」正式爆發首先是在福建。由於主持當地教會的耶穌會士艾儒略全面繼承了利瑪竇的傳教路線，被當地教內外紳民譽為「西來孔子」。他對中國文化採取了十分開明的做法，包括允許教徒們進祠堂、入孔廟。各地的中國信徒仍然保持著利瑪竇時期的舊習慣。這種寬容做法引起方濟各會的反對。1633年，方濟各會士李安堂到達福建宣教，他對耶穌會神父們居然容忍教民奉行異端大感震驚，便聯合多明我會反對耶穌會的做法。
多明我會在歐洲是神學權威，長期以來，他們主持教廷的宗教裁判所，對裁判異端特別有發言權。但是多明我會對中國文化問題缺乏內在的觀察，也沒有儒家士大夫作朋友，且宣教重點在南洋群島，台灣、福建是他們的延伸部分，在中國內地也沒有宣教士。上述這些對他們的影響是雙重的：一方面是對中國的文字傳統缺乏瞭解；另一方面是對福建地區格外嚴重的迷信活動感觸尤深。
宗教裁判所裡的多明我會神學家們很少來過中國，他們對中國禮儀問題的看法基本上是在歐洲形成的。當時歐洲人對中國文化的認識，基本上源於《利瑪竇中國札記》和另一本西班牙人拉達寫的《菲律賓群島的征服-記大明的中國事情》來瞭解。前者代表耶穌會的觀點，贊同儒家禮儀。拉達是奧古斯丁會修士，到過福建，對中國禮儀大驚小怪，他的描寫對當時固執己見的歐洲人是觸目驚心的。多明我會開始發動禮儀之爭時，焦點正是集中在拉達最初提到的偶像問題上。他們堅持問：中國人在祭奠先人時，為什麼要把三杯酒中的第一杯酒灑在地上？為什麼會相信人死後，靈魂會在天上、地下和牌位之間來來去去？為什麼中國人見到什麼神的牌位就跪拜下去？按基督教神學觀念，這些確實不合教義。耶穌會很難回答。
爭論開始只局限在遠東進行，在福州、廣州、馬尼拉，在耶穌會表示不合作之後，馬尼拉主教決定把矛盾上交到羅馬。1645年，教廷的宗教裁判所的神學家根據在閩宣教的多明我會莫若翰的一面之辭，作出了有利於西班牙會士的決定。這份被認為是羅馬教廷關於「中國禮儀之爭」的首號文件，對耶穌會極為不利，且沒有妥協餘地。但根據現存的中西文獻看，它在中國內地沒有馬上產生很大影響。顯然當時中國正處於戰爭狀態。
1654年，耶穌會士衛匡國為「中國禮儀之爭」專程赴羅馬申辯，他解釋說，中國人的祭祀只是一種社會性的禮節，而不是宗教迷信。據此，教皇亞力山大七世於1656年作出決定：如果中國禮儀的問題如衛匡國所說，中國信徒可以行祭祀之禮。這是「中國禮儀之爭」的二號文件，它完全傾向於耶穌會。
1659年，羅馬傳信部給三位在中國的巴黎外方傳教會士發了一個不尋常的指示：「不要試圖去說服中國人改變他們的禮儀、他們的風俗、他們的思維方式，因為這些並不公開地反對宗教和良善的道德。還有比把法國、西班牙、意大利，或者任何其他歐洲國家，出口到中國去更傻的事情嗎？不是要出口這些歐洲國家，而是要出口這信仰。這信仰並不和任何種族的禮儀習俗相矛盾衝突。」
這種明白無誤的語言代表了十分開明的態度，這本可以使中國禮儀之爭早早結束，也可以使以後更多的中西文化衝突得到避免。可惜事實並不如此。同年，當已成為濟南主教的李安堂路過杭州時，衛匡國將上述意見和羅馬教諭轉達給他，這大大激怒了他。他從耶穌會士汪儒望處獲知了幾十年前耶穌會內部對中國禮儀問題的爭論內幕，還看到了龍華民留下的反對中國禮儀的文件。這使得李神父信心大增，派出一位方濟各會修士去歐洲告狀。
其間（1664—1670），在北京鬧出歷獄，大部分宣教士被驅逐到廣州，這23位神父（3位多明我會士，1位方濟各會士，余皆耶穌會士）在廣州耶穌會院裡召開傳教史上著名的「廣州會議」，他們在40天的會議中（1667年12月18日—1668年1月26日），對近百年的中國傳教活動進行全面總結，中國禮儀問題成為激烈爭論的焦點。最後以表決形式通過議案，大家在中國禮儀問題上繼續持妥協態度。1656年教皇亞力山大七世所作決定得到執行。
然而，簽了字的多明我會修士回到歐洲後，出版了《中國的傳統歷史、政治與宗教》，繼續判定中國禮儀為異端，在西方引起極大反響，得到虔誠信徒的，使羅馬又一次面對兩難境地。
在此關鍵時刻，中國又來了一批法國巴黎外方傳教會和教廷直屬傳信會的教士，其中就有使得中國禮儀之爭激化得不可收拾的法國巴黎大學神學博士閻當主教。1693年，在福建的閻當主教發出命令，要求在他的教區內嚴禁中國禮儀，且要摘去各地教堂中仿製的康熙帝賜給湯若望的「敬天」大匾。此外，閻當還發動了歐洲的神學家來他。1700年，經過30次討論，巴黎大學神學院定中國禮儀為異端。當時巴黎大學正在和耶穌會展開論戰，教皇雖然沒有馬上巴黎大學神學院的判斷，但也不得不引起重視。因各方壓力太大，1704年，教皇克萊芒十一世主持全面討論了閻當提出來的非議，結果斷然決定禁止中國禮儀。教皇特使鐸羅主教於次年抵達澳門，至此中國禮儀之爭越出了神學討論的範圍，甚至也不全是文化衝突，而是轉化成以羅馬教皇和中國皇帝為代表的教會權力和政治利益的衝突。
三、禁教政策
康熙開始並不想排教，只是想用自己的權威保全中國禮儀和天子的體面。他醞釀的重大計劃是將有100多年歷史的中國天主教會收為國有。辦法是讓所有在華的宣教士效忠自己，脫離與羅馬梵蒂岡的聯繫。他準備自己做在華天主教的庇護者。凡願繼續在華的教士必須表明遵守中國禮儀，領得印票才准傳教。票上寫：「西洋某國人，年若干，在某會，來中國若干年，永不回復西洋，已經來京朝覲陛見。為此給票。」由內務府發放，表示康熙視其為家臣。永不回西洋，類似現代意義的入中國國籍。
康熙對不願具結的傳教士採取了非常嚴厲的措施，下令將他們驅逐到澳門。在清朝皇帝中，康熙是最開放、最有西學興趣的。就個人而言，他真誠地喜歡天主教傳教士帶來的學術和思想，甚至經常把天主教教理掛在嘴上，寫在詩文裡，因此他設法不使衝突激化。但是皇帝個人的學問、思想和信仰上的嗜好，也必須服從王朝的總體利益和形象。祭天、祀孔、法祖，事關中國的國本、教化人民的傳統，他不能做出讓步。
克萊芒十一世在1715年3月再次發佈了嚴厲的禁令，這道禁令被稱為《自那一天》，因為禁令的第一句話是「自那一天」。禁令要求世界各地所有的中國禮儀之爭，都應該按本規定徹底結束。在內容上，此禁令除了重複1704年以來的嚴厲態度，還增加了一項宣誓內容，要求所有在中國的宣教士和將要訪問中國的人，都簽署一份誓言。誓言的正本或被認可的副本，必須交到宗教裁判所，否則不能在中國擔任聽告解、布道或主持彌撒的工作。
康熙讀到《自那一天》後，批道：「覽此告示，只可說得西洋人等小人，如何言得中國之大理。況西洋人等，無一通漢書者。說言議論，令人可笑者多。今見來臣告示，竟是和尚道士、異端小教相同。似此亂言者，莫過如此。此後不必西洋人在中國傳教，禁止可也，免得多事。」
康熙之後，雍正、乾隆兩朝都對天主教採取了嚴厲的查禁政策，且一直持續到鴉片戰爭前。天主教的宣教工作從此暫時轉入地下，但從未中斷過。