由於彼時到海外傳教的熱潮，當他聽說將增派傳教士去東方「遠征」時，就靜不下心來讀書了，未及完成學業（數年之後他才在印度完成神學課晉鐸），他就要參與其中。耶穌會會長恩准他前往洛雷圖聖殿參拜，好在途經馬切拉塔時與親人告別。但他急切之極，放棄了見父母的機會，也許他當時沒有想到，這原本會是他和父母的最後一面。1578年，他們一行14人在里斯本啟程，往遠東而去。接下來的那些年，他過著一種帶有《聖經》事跡色彩的生活，孤獨地穿行在無數異教徒中。現在，身在中國的利瑪竇爭取每年給家人寫一兩封信。儘管他常常寫兩份，分別經由葡屬印度果阿和菲律賓馬尼拉兩條路線發送，這些信件還是時常遺失，或者由於疏忽，或者由於海難，或者由於海盜的劫掠。所以後來他漸漸習慣以6-7年為一個時間週期（從發信至收到回信）。這樣的情形自然會影響到他寫信的動力。1594年，他從韶州寫信給一位朋友說，如此漫長的往復不僅意味著形勢的變化會使得信件內容失去意義，「而且，……我時常想，我寫了那麼多關於這裡生活的長信，收信人卻說不定早已不在人世。」最富有戲劇性的正是關於親人的消息。1593年，利瑪竇寫信給父親時已有15年不知道雙親的音訊了（他們只是在15年前利瑪竇從里斯本出發後給他發了封信）：「要是不那麼麻煩的話，我就能知道家裡的近況和你們是否依然健在，那我會是多麼快樂啊！」3年後，他從意大利的一位密友處獲知雙親去世的噩耗，連著做了好幾次彌撒表達哀悼。但這個他無法求證的消息並不確切。1605年，利瑪竇又震驚地獲知父親仍然健在，興奮難抑，他馬上寫了封極其熱忱的家信，並概述了自己這些年來在中國傳教的主要成就。結尾處他寫道：「我不知道這封信究竟會是在地球上找到你們呢還是在天堂：但無論如何我都要給你們寫信。」真的是在天堂。當這封信抵達馬切拉塔時，父親喬萬尼·利奇已經過世了；而當報告這一千真萬確之死訊的信回到他所在的中國，利瑪竇本人也已經死了。開荒與播種1595年6月，利瑪竇被迫離開南京。他不想再回到廣東去。自1583年抵達肇慶算起，他在廣東呆了12年，卻只付洗教徒100餘人。除了某些開明官員，從一開始，那裡的百姓、儒生、多數官吏就對他們的到來抱有敵意。
他們肇慶的住所為當地官員所奪取，韶州的房子幾次遭到暴徒破壞和劫掠。在此期間，兩位協助他的傳教士去世了。最初引領他進入中國的羅明堅則被上司范禮安派去羅馬說服教廷籲請大明皇帝允許自由地傳教。羅明堅再也沒能返回中國。4任教宗相繼在不長的時間內去世使他在羅馬一事無成。他只好留在了意大利，直到生命的終點（1607年）。現在，出乎意料的是，他在南昌的一切進展得異常順利。因為瞿太素的先期鋪墊和名醫王繼樓的引介，他結識了南昌的諸多官員和士人，還在宴會上認識了皇親建安王和樂安王。當地著名學者、白鹿書院的院長章潢也很看重他。他的交際圈迅速擴展，江西巡撫陸萬垓和他會面後也盛情邀請他留在南昌。此後拜訪他的人與日俱增，以致他白天忙得沒時間讀祈禱書，只能在夜裡補上。有些拜訪者是衝他的「煉金術」來的。這一聲名早在他來之前就在南昌傳播開了。他越是向他們保1592年的夏天，一群中國書生襲擊了利瑪竇在韶州的住所，他從窗口跳出時扭了腳。澳門的大夫們無法治癒他的腿傷，使他從此落下殘疾。這位虔誠的耶穌會傳教士在中國前後居住了27年，他的傳教事業也是一瘸一拐的，一隻腳拖著失望，另一隻腳拖著希望。
在中西文明交流史上，傳教士是一群被忽視、更多的時候被臉譜化的一個群體，而事實上，撇開宗教意義上的執著，他們確乎在科學技術上的傳播上起到了至關重要的作用。從晚明到清朝中期，先後有500多位耶穌會教士來到中國，中國人從他們那裡學會了大炮鑄造術、曆法、地理、算術、天文、代數、繪畫、建築和音樂。同時，教士們也將中華文明介紹到了歐洲，比如，把孔子哲學翻譯成了意大利文，教會了英國人飲茶，讓整個歐洲王室瘋狂地喜歡上了中國的瓷器和絲綢。
最早到達中國的耶穌會傳教士是范禮安，他於1577年抵達了澳門，接著他委派兩位意大利籍教士進入中國內地傳教，他們是羅明堅和利瑪竇。
羅明堅和利瑪竇於1583年定居於廣東肇慶，他們改傳中式服裝，學習漢語，採用中國式的行為規範。他們首要的目的不是爭取信徒，而是為基督教爭取一個在中國社會中被接受的地位。
利瑪竇在肇慶和韶州住了十五年，在南昌和南京住了五年，在士大夫名流中結識了很多朋友。在很多人的眼裡，他首先是一位喜愛中國文化的外國人，以及著名的算術、天文學者以及世界地圖繪製者，最後才是一個天主教傳教士。
利瑪竇畫過兩張世界地圖——《坤輿萬國全圖》，從中可以讀出他善於妥協的智慧。
在第一張地圖上，美洲和亞洲分別被畫在圖的左右，歐洲居於中間，很顯然，這是一個嚴重的失誤，它挑戰了中國乃「中央之國」的概念，看到這張地圖的中國人沒有一個表示喜歡和認可。利瑪竇很快改正了「錯誤」，他知道地球是圓的－－而不是中國人所堅信的是方的，中國在地圖的哪個方位僅僅是視角的不同而已，他改而把中國畫在了地圖的中間。情形馬上有了改觀，有人將此圖獻給了萬曆皇帝，萬曆非常喜歡，吩咐欽天監用絲線織出，放進屏風裡。
在贏得了相當的民間知名度後，利瑪竇趕到北京，想要直接拜見萬曆皇帝，他結交、奉承太監，進獻了很多禮品，其中包括耶穌畫像、十字架、報時鐘和望遠鏡等等。他最終沒有能夠見到萬曆，不過卻被恩准在北京居住。在這裡，他結識了不少達官貴人，也發展了一些皈依者，其中最著名的是翰林院學士、後來當過內閣大學士的徐光啟（1562－1633）。
徐光啟是松江府上海縣人，出身於商人家庭，1593年，屢試不中的徐光啟南下到廣東韶州當教師，在這裡，他第一次接觸到了耶穌教士，正是從這些人口中，他第一次聽說地球是圓的，有個叫麥哲倫的西洋人乘船繞地球環行了一周；還第一次聽說意大利科學家伽利略製造了天文望遠鏡，能清楚地觀測天上星體的運行，他還第一次見到一幅世界地圖，驚奇地發現在中國之外竟還有那麼大的一個世界。
所有這些，對於一位從小讀「四書五經」長大的上海書生來說，實在是聞所未聞的新鮮事。不過，徐光啟並沒有視之為異端邪說，在他所處的時代，中國的經濟總量佔全世界的三分之一，歐洲十四國的經濟總量之和約佔四分之一，無論在經濟還是在心態上，明朝人都不可能有自卑感，就如同歐洲人羨慕中國的印刷術和瓷器一樣，徐光啟也對來自異域的一切充滿了好奇，他對當時的學風很不以為然，認為「空疏之學」無濟於世，而西方知識則為他打開了另外一扇窗口。他得知耶穌會的會長是一個叫利瑪竇的大鬍子，便四處打聽他的蹤跡，兩人見面是在1600年的南京，三年後，徐光啟接受洗禮，全家加入了天主教，他的教名是保祿。又過了一年，徐光啟考中進士，從此步入仕途。
徐光啟是一個才華橫溢的人，在農業、數學、天文和軍事上都有很深的造詣，而很多知識正來自於利瑪竇等耶穌教士。
在京為官期間，他向利瑪竇學習西方數學知識。中國古代數學源遠流長，漢代有《周髀算經》和《九章算術》，宋元時期達到發展的高峰，但進入明朝之後，宋元數學後繼無人，竟至衰廢。徐光啟對此至為焦慮，他說：「算術之學在近代數百年中被徹底荒廢，原因有兩個，一是儒生都去談名理之學，沒人關心實務，二是算術被神秘化，都用來算命卜卦。」利瑪竇教徐光啟的教材是希臘數學家歐幾里得的《原本》，1607年，他們合力譯出了這部著作的前六卷，徐建議把書名譯成《幾何原本》，「幾何」一詞從此誕生，在這本書中，他們還定命了眾多數學概念，比如「平行線」、「三角形」、「對角」、「直角」、「銳角」、「鈍角」、「相似」等等。徐光啟畢生熱衷於翻譯工作，在他看來，「欲求超勝，必先會通。會通之前，必先翻譯。」
利瑪竇在1610年就去世了，徐光啟與耶穌會的關係卻從未斷絕。1612年，他與傳教士熊三拔合譯《泰西水法》，書中介紹了西洋的水利工程作法和各種水利機械。1613年，因為庇護傳教活動及與其他官員的朝見不合，徐光啟辭職，在天津置地從事農業試驗，他做了大量的筆記，日後寫成《農政全書》，這是一部百科全書式的農學巨著。
1629年，徐光啟受命組建歷局，主編《崇禎歷書》，該書凡137卷，引進大量的歐洲古典天文學知識，構築了此後200多年間中國的官方天文學體系，湯若望（日耳曼人）、羅雅谷(葡萄牙人)、龍華民(意大利人)等傳教士先後參與了編製工作。
徐光啟晚年深受崇禎信任，被任命為禮部尚書，在他的努力下，一直被壓抑的耶穌會漸漸進入了主流社會，很多有學問的傳教士為朝廷服務，行走於朝堂之上，其中最出名的是湯若望（1592－1666）。跟利瑪竇一樣，湯若望是一位狂熱的、受過良好科學訓練的傳教士，他在協助徐光啟完成《崇禎歷書》的同時，還翻譯了德國礦冶學家阿格裡科拉的《礦冶全書》，中譯本定名為《坤輿格致》。後來，他受命以西法督造戰炮，並口述有關大炮冶鑄、製造、保管、運輸、演放以及火藥配製、炮彈製造等原理和技術，由中國學者整理成《火攻挈要》二卷和《火攻秘要》一卷，為當時介紹西洋火槍技術的權威著作。明滅清興之後，湯若望仍然得到重用，被任命為國家天文台的台長（欽天監監正），受封「通玄教師」，年輕的順治帝非常信任湯若望，稱他為「法瑪」（老爺爺），1656年到1657年的兩年裡，順治曾二十四次到湯若望的住所登門請教，甚至在那裡度過了自己的19歲生日。
從利瑪竇進入中國，到湯若望去世，前後八十餘年，在西方傳教士和徐光啟等人努力下，天主教得到了較廣泛的普及，眾多的西方科學知識也在知識階層得到認可和應用。這是中西方歷史上的第一次「知識大交易」。可惜的是，進入康熙朝後，湯若望遭到中國官員攻擊，他本人僥倖逃過處罰，而與他一起參與天文工作的傳教士則大多被處死。
在中國科技史上，如何看待明末清初的這場中西科技「蜜月」，一直是一個有重大分歧的課題。李約瑟認為這是一場中國式的科學革命，「西方與東方的數學、天文學、物理學一旦發生接觸就很快結合。到了明末即公元1644年，中國與歐洲的數學、天文學和物理學之間已經再也沒有任何可覺察的分別，它們已經完全熔結，它們融合了。」而持反對意見的學者則反問說，「如果這真是一場革命，那麼，為何利瑪竇等耶穌會傳教士所傳入的西方科學沒有觸發中國科學更劇烈、更根本的巨變？」
利瑪竇和湯若望均葬於北京阜成門外，兩墓前後相望，古木拱衛。徐光啟去世後回葬於家鄉上海，他在法華涇一帶曾建家庭農莊，從事農業實驗並著書立說，其後裔在此繁衍生息，漸成集鎮，得名為「徐家匯」。