周恩來早年立志救國，在中學時期就開始注意軍事問題。他在天津時和同學們發起成立敬業樂群會，當時就曾經在會中設立「軍事研究團」。他發起組織國防演說會，請人講「軍艦——炮台——陸路」，引導青年學習軍事知識。旅歐時期，他領導的中共旅歐支部中專門設立了軍事部，這是當時中共中央和其他地方黨組織都沒有的。他很贊成德國革命家盧森堡提出的「我們要無軍隊，便不能革命」的主張，認為「這都是見到之語」。1922年，他發表《評胡適的『努力』》一文，批判胡適所謂建立「好人政府」的主張，認為「都是些不落實際的廢話」，在中國，「以為在世界帝國主義和軍閥的支配下，便可建立『好人政府』實現其政治主張，這不是做夢麼？」他說：「若徒以手槍、炸彈、罷工、罷市來恐嚇，則手槍、炸彈他有躲避之法，罷工、罷市他更可以軍隊來壓迫。」他明確指出：「真正革命非要有極堅強極有組織的革命軍不可，沒有革命軍，軍閥是打不倒的。」
1924年7月下旬，周恩來回國，9月初到廣州。這時正是商團叛亂的時候，革命軍擊潰商團軍，周恩來參加了臨時軍事指揮部的工作。隨後，他出任黃埔軍校教官，11月任黃埔軍校政治部主任；同時又是中共廣東區委常委兼軍事部部長。
黃埔軍校區別於舊軍校的一個顯著特點，就是設有黨代表和政治部。軍校的一切命令，都必須由黨代表副署交校長執行，未經黨代表副署無效。政治部負責軍校的政治思想教育工作，政治部主任是黨代表的參謀長，是相當重要的。但是初期的政治部工作閒淡，形同虛設。在中國軍事史上具有開創意義的軍隊政治工作的建立，是由周恩來在黃埔軍校開始的。
周恩來到職後，健全政治工作制度和建立日常的工作秩序，設立指導、編篆、秘書三股，選員任職，重新制定政治教育計劃，加授「社會進化史」、「帝國主義侵略中國史」等課程，主要是講授中國怎樣受帝國主義列強的壓迫，中國的農工商備界怎樣受封建軍閥的壓迫以及解脫的途徑及辦法。他建立和健全共產黨與青年團組織，成立了中共黃埔軍校特別支部，發動黨團員和進步青年開展工作。他提出了軍隊政治工作的方針、方法和目的，指出：「政治工作就是使軍閥軍隊漸漸覺悟，革命軍隊確實具有革命觀念」，「革命軍的行動要依著黨的政策」，以公開講演，找士兵個別談話等方式，「使官佐士兵及一切群眾曉得黨的理淪、主義、政策」。周恩來平易近人，聯繫群眾，經常在軍校內的大榕樹下同學員們促膝談心。學員們思想覺悟迅速提高，軍校出現了生動活潑的局面。
黃埔軍校第一期學生畢業後，以他們為骨幹組建兩個教導團，每團約1000多人，編製采三三制。每連有9名軍官，一半左右是共產黨員。這支以共產黨員為核心的部隊，在統一廣東革命根據地的歷次戰役中，成為革命軍中一支勁旅。這時，周恩來把平時的政治教育轉變為戰時政治工作，在實踐中逐步創立一套新型的軍隊政治工作。後來毛澤東說：「那時軍隊設立了黨代表和政治部，這種制度是中國歷史上沒有的，靠了這種制度使軍隊一新其耳目。1927年以後的紅軍以至今日的八路軍，是繼承了這種制度而加以發展的。」朱德也說：「研究黨的軍史時，應當從這個老根上研究起。」
周恩來解決了建立革命軍隊的一系列重大理論問題。關於建軍的宗旨與任務，他指出：孫中山設軍校是要建立「為人民所用之軍隊」，「軍隊之打仗是為人民而打的」。革命軍隊的任務，「是實現我們理論的先鋒」。關於軍隊和黨的關係，他指出：「革命軍是黨的軍隊，革命軍的行動要依著黨的政策」，革命軍隊「是為主義為黨國而奮鬥的」。關於政治思想工作，他指出：「部隊政工是革命的靈魂」。「我們做政治工作的使命，對於官長官佐要鞏固其革命觀念。對於士兵要使之有革命常識，所以我們要認識革命化、紀律化、統一化。就系統方面說，政治部是軍隊組織裡面的一部分，要輔助各部處的工作，以進行政治教育實施的目的。」對於軍隊同人民的關係，他指出：革命軍隊必須同人民緊密團結，革命軍「是為人民解除痛苦而來，但全恃本校軍隊，力量太小，若無人民援助，仍不足負重大責任」。
周恩來還籌建了一支特種革命隊伍——大元帥府鐵甲車隊。這實際上是中國共產黨直接領導下的第一支革命軍隊。後來，這支隊伍擴建成為國民革命軍第四軍獨立團，成為北伐軍的先鋒。
1925年，革命軍進行了兩次東征，周恩來都是政治部的領導人。他規定了「不拉夫，不籌餉，不強佔民房，不用軍用券」等。東征軍紀律嚴明，雞犬不驚，當時曾有「莫走人家取門板，莫拆民房搬磚石，莫踏禾苗壞田產，莫打民間鴨和雞」的《愛民歌》。「革命軍所到之地，人民樂於貿易，自願幫助運輸並代作偵探工作，所以作戰順利，一戰而克服東江，此乃中國軍隊第一次戰時政治工作之成績。」
在東征中，周恩來不僅取得了政治部工作的實踐經驗，而且有了軍事指揮、後方勤務和地方行政工作的實踐。
第一次東征中，他參加了進攻淡水之役。淡水是一個地勢險要，易守難攻的城池，陳炯明部約4000人守城。蔣介石、周恩來等聽葉劍英匯報了敵情和作成方案，詳細商計了攻城計劃。2月13日發起攻擊，周恩來和各級黨代表鼓勵學生軍奮勇戰鬥，協同粵軍第二師佔領了淡水。第二次東征中，周恩來參與指揮了攻打惠州城的戰役。在戰爭的關鍵時刻，他命令蔣先雲組織以共產黨員和共青團員為骨幹的敢死隊強行登城。惠州攻克，取得了這次東征的決定性勝利。接著，他又與何應欽率第一師攻佔海豐，同陳炯明部近萬人決戰於華陽、河婆一帶，全殲敵中路主力。陳炯明殘部退入福建，東征軍入閩追殲，周恩來留在汕頭主持後方工作。東征勝利結束後，他受命行政主要職務。他幫助地方建立政黨、政權和工會、農會等組織，擴大了軍隊的群眾基礎。
在兩次東征之間，廣州發生了著名的沙基慘案。6月23日，為了聲援「五卅」後上海工人的鬥爭，香港口廣州的罷工工人和廣州的工人、農民、士兵、學生10萬人遊行示威，經過沙面租界對岸的沙基村時，遭到英、法等國的武裝鎮壓，死50餘人，重傷170親人。周恩來參加了群眾遊行隊伍，3個人一排行進，機關鎗掃射過來，他兩邊的人都中彈身亡，他得以倖免。這是他回國後領導群眾鬥爭遇到的第一次險情。他總是勇於站在鬥爭的第一線。
1926年12月，周恩來離開廣東到上海，任中共中央組織部秘書和中央軍委委員，次年2月，任中共上海區委軍委書記。
2月23日，中共中央、中共上海區委舉行聯席會議，決定成立特別委員會，由陳獨秀、羅亦農、趙世炎。何松林（汪壽華）、尹寬、彭述之、周恩來、肖子璋組成；並決定成立以周恩來為首的特別軍委，準備進行上海工人第三次武裝起義。武裝起義發動時，周恩來擔任了總指揮。
北洋軍閥駐在上海的，是畢庶澄部，約3000人，加上當地警察共5000人左右，兵力不強，軍心不穩。這對於舉行起義是有利的。陳獨秀作為中共中央總書記、特委負責人，對於這次起義是積極的，對組織起義也提出過正確的意見。但是他認為起義是「群眾的奪取武裝，群眾的開代表大會」，不主張組織和訓練工人的武裝隊伍。周恩來不同，他認為敵人部隊對我們能起多大作用，這取決於我們對工人的武裝程度，取決於工人擁有的力量。他重視「自己的準備」，「糾察隊、自衛團都有規定特別工作」，「並加暴動起來奪取武裝」。周恩來根據特別軍委的討論，提出了軍事工作的綱領性計劃，包括建立領導機構，組織武裝力量，加強隊伍訓練，準備武器，搜集情報，並且加強敵軍工作，核心是建立一支由中共直接領導的有戰鬥力的武裝隊伍，成為武裝起義的主力。他們組織了糾察隊2300人，赤衛隊800多人，特別隊數百人。周恩來親自到各訓練地點作政治報告成進行軍事訓練。
上海工人第三次武裝起義在1927年的3月21日發動了，整個行動，由特委會議指揮，緊急時由羅亦農、周恩來、何松林（汪壽華）、陳獨秀捐揮。周恩來分工在南市指揮，後來又到閘北前線。他身穿灰布棉袍，頭戴鴨舌帽，在總指揮部對著地圖同趙世炎邊商量，邊決定，聽取報告，指示行動。經過28小時戰鬥，攻下北洋軍閥在上海的最後一個據點——北火車站。起義取得了勝利，完全是靠有織織的產業工人武裝作戰，打敗了幾千反動軍警。這是中國工人階級依靠自己的力量武裝起義勝利的光輝一頁。
工人起義勝利了，蔣介石等率北伐軍進入了上海市，卻準備著對起義的工人階級下毒手。4月11日夜到12日凌晨，他們用陰謀詭計繳了工人糾察隊的械，13日，開始了瘋狂的屠殺和搜捕。昔日的盟友徹底地露出了反動面目，是一個狠毒凶殘的劊子手。大批共產黨員和工人群眾倒在血泊中，中國共產黨的組織被迫轉入地下。周恩來起草了電報，與趙世炎、羅亦農、陳延年、李立三、尹寬聯名致中共中央，主張迅速出師討伐蔣介石。電報中分析了軍事力量對比，認為蔣介石處於不利地位。「為全局計，政治不宜再緩和妥協」。但這一建議未為蘇聯顧問鮑羅廷和陳獨秀所採納。
1927年5月下旬，周恩來由上海秘密到達中共中央所在地武漢。此前，在漢口召開的中共第五次全國代表大會上，周恩來被選為中央委員；在五屆一中全會上，又被選為中央政治局委員。25日，中央政治局常委會議決定周恩來任中共中央軍事部部長，必要時參加常委會議。29日，中央政治局常委會議決定周恩來代理中央常委職務，參加中央核心領導。從此以後，在長達半個世紀的時間內，周恩來一直是中共中央的主要領導人之一。
周恩來領導軍事部後，以聶榮臻、王一飛、顏昌頤、歐陽欽等為助手，進行了對軍隊的組織、聯絡，加強了軍隊的政治工作，向國民革命軍中派去朱德、陳毅、劉伯承等不少幹部，並負責指導武漢的工人糾察隊和湖南、廣東的農民運動。這時，國民革命軍獨立第十四師師長夏斗寅在宜昌發動的武裝叛變雖已擊退，長沙許克祥又發動了反革命的「馬日事變」，武漢汪精衛叛變革命的跡象越來越明顯，周恩來主張在農民運動力量強大的湖南農村發動武裝起義。6月17日，他在中共中央常委會上提出，現在湖南18縣有8000枝槍，可以派人去集中起來，攻取反動力量弱的城池，計劃取湘潭，集中瀏陽、平江，省委下設軍委，各區設農軍委員會，在可能範圍內成立鄉村的臨時委員會，對許多反動軍隊強則擾之，弱則繳其械。會議同意了這一佈置。20日，周恩來在中共中央常委會上又說：湖南省委決定派50人回去，把湖南劃為10個區，派10名懂軍事的幹部去，作好準備，根據政治局決定進行暴動。但這些意見遭到共產國際代表的反對，沒有實現，陳獨秀在7月5日的中央常委會上甚至說：軍事工作應該收縮。
7月15日，汪精衛背叛孫中山的國共合作政策。他同蔣介石一樣，對共產黨員和革命群眾進行大屠殺。
中國共產黨決定舉行南昌起義。
南昌起義的建議最早是誰提出來的？是周恩來。周恩來講過這個過程，南昌起義的提出是這樣的：「那時，軍委想可否搞個起義，主要是鮑羅廷跟加倫說可以搞個起義，國際決定上沒有。」而周恩來當時正是軍委領導人。這時間是在7月中旬。根據這個考慮，周恩來向在軍委工作的幾個同志佈置，指定賀昌、顏昌頤、聶榮臻組成前敵軍委，聶榮臻為書記，任務是先到九江去，通知同志們瞭解這個意圖，作為起義的準備。什麼時候發難，要聽中央的命令。
7月26日，周恩來由陳賡陪同到九江，27日到南昌。當時，中共臨時中央常委會議已經正式決定，成立由周恩來、李立三、惲代英、彭湃組成的中共前敵委員會，周恩來為前委書記，用國民黨革命委員會的名義在南昌舉行武裝起義。
8月1日凌晨，周恩來和賀龍、葉挺、朱德、劉伯承等領導在中國共產黨掌握和影響下的國民革命軍2萬餘人舉行起義。經過幾個小時的激烈戰鬥，全殲駐南昌國民黨軍3000餘人，於拂曉佔領南昌。
南昌起義開始了中國共產黨獨立地領導革命武裝鬥爭和創建人民革命軍隊的新時期。從此，8月1日成為中國共產黨領導下的革命軍隊的光榮節日。1933年6月30日，中央革命軍事委員會決定以南昌起義的8月1日為中國工農紅軍成立紀念日，中華蘇維埃共和國臨時中央政府批准這個決定。中華人民共和國成立後，確定8月1日為建軍節。
起義勝利後，周恩來出席在原江西省政府召開的有中國共產黨人和國民黨左派人士參加的聯席會議。會議選出宋慶齡、鄧演達、何香凝等25人組成中國國民黨革命委員會。周恩來當選為委員，並被任命為參謀團委員。
同日，經周恩來修改定稿的《中央委員宣言》也發佈了。宣言指出：「武漢與南京所謂黨部政府，皆已成為新軍閥之工具，曲解三民主義，毀棄三大政策，為總理之罪人，國民革命之罪人」。宣言提出號召一切革命力量共同努力，為獲得一個新根據地，解決土地問題，反對帝國主義、封建勢力和一切新舊軍閥而鬥爭。
南昌起義的軍事計劃，是加倫制定的。當時說是蘇聯運來一船軍人，起義軍到汕頭一帶海口就可取得，因此，軍事計劃就定在起義軍南下廣東取得海港，得到蘇聯軍火接濟上。8月1日晚，周恩來主持參謀團委員會議，討論南下行軍路線問題。為了避免國民黨軍隊的尾追堵截，盡快與東江農民暴動聯絡，會議決定選擇走國民黨兵力較為薄弱的由贛東經尋鄔直取東江的行軍路線。2日，中共前委對起義部隊作了整編，決定沿用國民革命軍第二方面軍名義，下轄三個軍，賀龍代第二方面軍總指揮兼第二十軍軍長，葉挺代前敵總指揮兼代第十一軍軍長，朱德為第九軍副軍長。起義軍從8月3日起，分批撤離南昌南下。
周恩來於8月5日隨革命委員會機關撤離南昌。他的一生，勤勤懇懇，發憤為公，當年就已經如此。29歲的周恩來率領著幾萬人的起義軍，由南昌向南挺進。有戰士寫道，「每天，當行軍休息下來的時候，因為過度疲勞，我們總是一倒地就呼呼入睡。往往一覺醒來睜眼還看見周恩來同志在豆油燈下工作，或者踱著步子，默默沉思。」「我們對待周恩來同志的命令是絕對服從的，從不敢懈怠。這是因為周恩來同志對部下要求非常嚴格，而他對自己的要求尤其嚴格。」
12日，起義部隊到達宜黃，周恩來同趕到部隊來的陳毅談話，任命他為第十一軍第二十五師的主力團——第七十三團的指導員。
8月26日，起義軍在瑞金以北的壬田，同佈防在瑞金、會昌一線的國民黨軍錢大鈞部兩個團遭遇，將其擊漬，進佔瑞金。在這裡，周恩來從報紙上得知各地國民黨新軍閥封閉工會、農會，捕殺共產黨員和工農群眾的消息，感到再繼續沿用國民黨的名義已經不合適。他主持召開中共前敵委員會議，決定要建立無產階級領導的聯合貧苦小資產階級的工農政權，提出鄉村政權應完全歸農民，並須以農民為中心，城市政權，工人須佔絕對多數。
30日，周恩來和葉挺，劉伯承、聶榮臻等，指揮起義軍擊潰國民黨軍錢大鈞部九個團，佔領會昌。在這裡召開的中共前敵委員會議上，決定由福建長汀（汀州）、上杭進入廣東東江地區。9月5日．周恩來率起義軍到長汀。他主持中共前敵委員會議討論攻取東江的計劃。會上，周恩來和葉挺的主張是：國民黨軍在潮汕兵力空虛，無險可守，潮汕可以不戰而得，因此如果以主力取潮汕然後再折回取興寧、五華，攻惠州，就過於迂緩，會使國民黨軍有集中兵力，搶佔有利地形攻擊起義軍的可能，應以主力由三河壩經鬆口取梅縣；再經興寧、五華取惠州，而以小部兵力，至多兩個團趨潮汕。但是，會上多數人和共產國際軍事顧問都主張以主力取潮汕，留一部分兵力在三河壩監視梅縣方面敵軍，再經揭陽出興寧、五華取惠州，以便得到共產國際接濟。後來，就按多數意見作出了決定。這個決定，是遭致後來失敗的一個重要因素。
9月10日，周恩來和彭湃率一團起義軍佔領上杭。19日，占廣東大埔縣的三河壩。在三河壩，起義軍實行分兵，由朱德率第十一軍第二十五師和第九軍一部留守三河壩，周恩來、賀龍、葉挺、劉伯承等率主力進軍潮汕。23日進潮州，24日駐汕頭。
在潮汕，起義軍因為籌辦軍餉，延宕到26日才向揭陽集中，而這時，敵人重兵乘起義軍進潮汕之機，搶先佔領了揭陽、湯坑一帶有利陣地。起義軍入廣東時共有兵力約10700人，這時二十五師約3000人留在三河壩，第二十軍第三師約1000人留守潮汕，只有6000親人的兵力進攻敵人。面對三倍於已的放軍，起義軍雖然作戰勇敢，終因連續苦戰，疲憊不堪，未能獲勝，而另一路敵軍已繞道後背，進佔潮州。9月30日晚，周恩來主持召開中共前敵委員會議，決定放棄汕頭，向普寧及海陸豐撤退。10月3日，他和賀龍、葉挺等到達普寧縣的流沙。周恩來在這裡召開了緊急會議，宣佈打出蘇維埃的旗幟，實行土地革命，決定武裝人員去海陸豐幫助農民開展鬥爭，自己隨部隊行動；其餘領導人分別轉往香港或上海。
這時，周恩來正患惡性瘧疾，連日發高僥，病勢沉重。在當地中共組織的掩護和葉挺、聶榮臻的扶持下，乘小船到了香港治病。起義軍餘部，在顏昌頤、董朗率領下進入海陸豐地區同當地農軍會合，組建為工農革命軍第二師。留守三河壩的起義軍，在朱德指揮下與國民黨軍錢大鈞部激戰後突圍轉移，然後在朱德、陳毅率領下，轉戰閩、贛、粵邊，到湘南發動了年關起義，擴大衣軍隊伍達萬人，最後上井岡山和毛澤東率領的秋收起義部隊會師。
起義軍南下雖然失敗了，但南昌起義是勝利的。它打響了武裝反抗國民黨反動派的第一槍，開始了中國共產黨領導下武裝的革命反對武裝的反革命的歷史。