1964年10月16日，我國爆炸了第一顆原子彈，成功地進行了第一次核試驗。
17日，周恩來以國務院總理名義向世界各國政府首腦發出電報，說：
「中國政府一貫主張全面禁止和徹底銷毀核武器，中國進行核試驗、發展核武器，是被迫而為的。」
「中國政府鄭重宣佈，在任何時候、任何情況下，中國都不會首先使用核武器。」
原子彈爆炸的成功吸引了全世界的目光，一夜之間中國跨進了核大國行列，全世界刮目相看。可是要做到這一步，卻不知花費了多少人其中包括了周恩來的心血和精力。
發展我國的科學技術事業這件事，周恩來很早就已放在心上了。早在1949年春季，解放中國的炮聲還在祖國南方大地上隆隆作響，要出國參加保衛世界和平大會的錢三強，想趁機在法國定購中型迴旋加速器的電磁鐵和其他一些儀器、圖書、資料等。他提了這個想法，又有些後悔，因為人民解放戰爭正在進行，解放區的經濟很困難，要拿出外匯實非易事。但是周恩來批准了。這件事使得中國的科學家感到在中國共產黨的領導下，中國新興科學的發展大有希望。新中國建立後，從1950年到1954年，在周恩來的支持和關懷下，中國科學院近代物理研究所用錢三強定購回來的這批儀器、資料和我國自己製造的實驗設備，在20多個學科領域開展研究，培養骨幹，為創建我國核事業作了基礎準備。
1955年1月31日，周恩來在國務院全體會議上提出：我們應該使全世界人民知道，原子能如果為和平建設服務，就可以造福人類，如果為戰爭服務，就是毀滅人類。我國為了反對核戰爭，保衛和平，把原子能用於國家建設，造福人民，就要進行嚴肅認真的工作，必須掌握原子能。
就在這一月，周恩來把薄一波、李四光、錢三強找到辦公室，詳細瞭解我國核科學技術研究和鈾礦資源情況，告訴他們中央將要開會研究。接著，毛澤東親自主持召開中共中央書記處擴大會議，討論中國發展原子能事業問題，劉少奇、周恩來、朱德、陳雲、彭德懷、鄧小平、彭真、薄一波等都參加了。會上，李四光、錢三強等匯報後，作了用儀器探測鈾礦石的操作表演，當儀器接近鈾礦石發出嘎嘎響聲時，大家高興地笑了。毛澤東說：這件事總是要抓的。現在到時候了，該抓了。只要排上日程，認真抓一下，一定可以搞起來。周恩來特別強調說：對人力培養要大力加強。這次會議對我國核科技研究和核工業建設有重大歷史意義。按照周恩來關於要「迅速地建立和加強必要的研究機構」的指示，到1958年，我國建設成了第一個比較完整的綜合性的核科學技術研究基地。
當時，周恩來的思想是：我們要「能夠製造新式的保衛自己的武器，像國防方面的原子彈、導彈、遠程飛機」，「要根本上解決，就必須自己製造」。火箭專家錢學森回國不久，周恩來就親自交代他寫了一個《建立我國國防航空工業的意見書》，1956年4月，周恩來主持中央軍委會議，聽取錢學森關於在中國發展導彈技術的規劃設想，決定組建導彈航空科學研究方面的領導機構——航空工業委員會，他親自牽頭負責籌備。導彈研究設計院、核武器研究設計院等一系列科學研究機構相繼成立，大力推動了我國國防科研事業的發展。聶榮臻曾經說，「1956年總理找我和學森同志談組織航空工業委員會的事。就是說，我們要搞『兩彈』。那時候，主席也下了決心的，周總理很重視。」
1956年，周恩來親自領導制定我國第一個科學技術發展的十二年規劃。在制定這一規劃過程中，他特別注意聽取各方面科學家的意見，包括不同的意見。討論中，出現了兩種不同意見：一種認為，中國科學技術不發展，主要是基礎科學太差，科學家太少，應該按照科學家的專長來開展工作，也就是按學科和專長來制訂發展規劃；另一種認為，中國科學技術差，更應該瞄準世界先進水平，補齊缺門，基礎科學要重視，但技術科學對國民經濟的發展更有直接影響，應以此為重點，也就是按國家需要，逐步建立起與國民經濟相適應的各種科學技術研究機構，重點加強與生產的銜接工作。兩種意見反映到周恩來那裡，他表示：科學研究不能只為促進科學發展而發展，應該面向國民經濟發展和國家現代化的總任務。於是，大家按照這個方針，擬訂十二年發展目標和分類課題，起草成分科規劃。周恩來認為，這許多不同學科中，總要有重點，沒有重點就沒有政策。對什麼是重點，大家在討論中又出現重大分歧。一部分人認為國民經濟發展的重點是重工業，而重工業的基礎是鋼鐵，科學技術的發展應以此為重點；另一部分人認為要實現現代化的方針，重點應該放在發展現代科學技術上，以此來帶動傳統工業伎術和傳統工業的改造，缺門的學科也要及時建立，以縮小與先進國家的差距。兩種思路兩種對策，提請周恩來決定。周恩來認為：現代科學新技術是衡量一個國家發達水平的標誌，應當選定航天技術（當時叫噴氣技術）、核技術、半導體、計算機、電子學和自動化為重點。按照周恩來的指示，經過充分討論，最後選定了57項重要任務。
這時候，我國除電子學、自動化外，全是一片空白。要從頭建立，談何容易。「兩彈」是大規模的科學技術研究，要有幾千人、上萬人的協作，組織是十分龐大的。周恩來親自召集會議，從事組織工作和各方面安排，曾經組織過上百個部、委、局級單位，26個省、市、自治區和上千個廠、礦、院校、所，以及各軍兵種的有關單位，分工協作，聯合攻關。這種情況，是只有在社會主義制度下和在中國共產黨的統一領導下才能做到的。人力集中了，中國科技大學創辦了，北京大學、清華大學等一批高等院校都辦起了有關的科系或專業。1958年，我國第一台電子管電子計算機研製成功，第一枚探空火箭上天；1959年我國研製成功半導體晶體管電子計算機。科技十二年規劃提前五年，於1962年經過認真檢查，具體項目基本上完成了，從而有效地解決了一批我國國民經濟建設和國防建設中的科學技術問題，使我國科學技術水平提高一步，縮小了與世界先進水平的差距，為我國科學事業的發展打下了一個很好的基礎。1963年，周恩來提出，實現科學技術現代化的主要要求是，實事求是，循序前進，相互促進，迎頭趕上。
到了國民經濟困難時期，擺在面前的一個重大決策問題是：我們的導彈、核武器要不要繼續搞下去？是上馬，還是下馬？爭議相當激烈。周恩來的態度是非常堅決的，表示要決心搞下去。他的態度得到毛澤東的支持，認為不能放鬆，更不能下馬。周恩來提出，自己動手，從頭摸起，完全靠自己的力量搞出原子彈來。當時調整國民經濟，全國其他基本建設幾乎全部停了下來，但是這方面的工程不僅沒有下馬，反而有了很大的發展，決心要把原子彈、導彈搞出來。
1962年11月，在中共中央領導下成立了以周恩來為主任的專門委員會，有七個副總理、七個部長參加（賀龍、李富春、李先念、薄一波、陸定一、聶榮臻、羅瑞卿、趙爾陸、張愛萍、王鶴壽、劉傑、孫志遠，段君毅、高揚），領導我國的原子能工業建設和核科技工作。當時的國防部部長林彪曾經提出一個主張，叫做「兩彈為主，導彈第一」。這個主張沒有重點，使下面捉摸不透。周恩來在專門委員會第二次會議上，明確提出了「先抓原子彈」的戰略思想。在1962年12月4日的專門委員會第三次會議上，周恩來原則同意了二機部關於爆炸第一顆原子彈準備工作的「兩年規劃」。這個規劃在1963年3月的專門委員會會議上被正式批准。周恩來提出了「三高」的指導思想，即高度的政治思想性、高度的科學計劃性、高度的組織紀律性。
1964年我國第一顆原子彈爆炸試驗那一天，周恩來派張愛萍為現場總指揮，全權負責處理可能出現的問題。周恩來和賀龍、聶朵臻在北京，親自在電話機旁聽著現場指揮口令和倒數時間的聲音。張愛萍在核試驗場手持話簡向周恩來準確地回答提問和報告情況。試驗取得了成功，中華民族精神為之大振。世界友好國家和人民，紛紛向我國表示熱烈祝賀和同情支持。周恩來說：我們原子彈一響，美國的沖繩基地就向關島遷移了。他問二機部部長劉傑研製氫彈的安排考慮。劉傑答：現在還有許多問題吃不透，大約需要三五年時間。周恩來說，五年是不是太慢了？
從原子彈到氫彈，美國用了七年零四個月，蘇聯用了四年，英國用了四年零七個月，那時法國已經研製了四年多，還沒有搞成功。各國對研製氫彈的技術都嚴格保密，隻字不漏。二機部經過反覆論證，向中央專門委員會呈報了《關於加速發展核武器問題的報告》，把原理探索作為突破氫彈技術的首要措施，得到了周恩來的首肯。1965年2月3日和4日，周恩來主持第十次專門委員會議審議並批准了這個報告，決定：「力爭於1968年進行氫彈裝置的爆炸試驗。」也就是說，要以比美、英、蘇都快的速度把氫彈研製出來。
在氫彈的研製過程中，周恩來為大家制定了工作指導方針：「嚴肅認真，周到細緻，穩妥可靠，萬無一失。」這十六個字充分體現了周恩來一再強調的要「保證產品的高質量」和「絕對保證安全」的思想。他還制定了一系列指導方針，其中最重要的是1965年3月20日專門委員會議上他提出的「我們反對核訛詐和核威脅，不主張搞幾百次核試驗，因此我們的核試驗都要從軍事、科學、技術的需要出發，都要做到一次試驗全面收效」。按照這個方針，我國從1964年10月到1987年6月的近23年時間裡，只進行了33次核試驗，而美、蘇幾十年來分別進行了800多次和600多次核試驗。
1967年6月17日，我國成功地進行了一次300萬噸級的空投氫彈試驗，提前實現了原定的1968年進行氫彈試驗的目標。從原子彈到氫彈，是一個質的飛躍。實現這個飛躍，我國用了兩年零八個月，與美、蘇、英、法比，速度是最快的，技術水平也比美、蘇首次試驗的氫彈水平高。
以周恩來為首的專門委員會，最初只管核武器研製：1964年開始也管航天事業了。第一顆原子彈爆炸成功後，周恩來要以此帶動尖端事業的全面發展，並把專門委員會的工作轉移到戰略導彈和人造衛星上來。他說：「下半年重點抓戰略導彈。要從東風二號抓起。」對於原子彈，他指出：要加速小型化，我們要真正制止核訛詐，就必須有自己的真正核威懾力量。在當時，要真正具有核威懾力量，核彈就必須能裝在導彈上，否則是不行的。1966年10月27日，我國進行了原子彈和導彈結合的試驗，導彈裝上真的核彈頭，在自己國內從發射場打到降落地。聶榮臻親自指揮了這次試驗，試驗獲得了成功。
周恩來又提出：「兩彈結合進展順利，接著要抓戰術導彈（地空、海防）。」這也是他的用突破戰略武器來推動發展戰術武器的思想。專門委員會的第十三次會議上，確定了戰略、戰術導彈共有十幾個型號。周恩來進一步明確工作重點，指出戰術武器的研製工作，「要為地空導彈讓路」。在1965年12月29日至31日的第十四次專門委員會議上，周恩來還明確提出要求說：「明年是導彈年，要有收穫」，「明年中程、高空、核彈頭，有對空的、對航的、低空的，後年要出更大成果。」到1967年9月，我國防空部隊終於用自己國產的新型地空導彈，把改進了的美國高空偵察機擊落了下來。
也是在這期間，專門委員會原則批准了研製攻擊型潛挺。
原子彈、氫彈、導彈、人造衛星的成功，是周恩來關於我國科學技術發展的正確思想在科學實踐中的豐碩成果。這項工作，我國是從零開始的。錢學森說過：「大家想一想，假使中國沒有原子彈、導彈，那中國是什麼國際地位？」
周恩來對每次核試驗、導彈試驗和發射人造地球衛星，都要親自聽匯報，找專家咨詢，仔細檢查各方面的準備工作，要求把各種不利或意外因素都考慮到，採取最可靠的保險措施。他語重心長地告訴大家：核試驗關係重大，絕不能有一絲一毫馬虎，我們國家窮，做什麼事，都要考慮到，略有失誤，都會加重人民的負擔。正是由於貫徹了周恩來的指示，我國的「兩彈」試驗和外國相比，事故最少，傷亡最小，成功率最高。後來，1970年7月，核動力陸上模式堆運行試驗準備就緒，中央專門委員會進行討論時，周恩來著重審查了啟動運行的安全問題，井指出這是核動力的起點，也是奠定核電站的基礎。這年11月的一次專門委員會會議上，他提出我國發展核電站應當遵循「安全、適用、經濟、自力更生」的方針。1974年三四月間，他帶病最後一次主持專門委員會會議，審查並肯定了上海的核電站建設方案。
我國的國防科研和國防工業，能夠獨立自主地順利發展，十年動亂的嚴重破壞下也沒有中斷，並為大規模地發展科學技術創造了具有中國特色的成功經驗，這是和周恩來的親切關懷與正確領導分不開的。